Complex Design, Simple Implementation: The Development of Red Light-Regulated Nuclear Protein Shuttling and Enzyme-Free DNA Assembly

Protein shuttling in and out of the nucleus represents a key step in controlling cell fate and function. Here we demonstrate a red light-inducible and far-red light-reversible synthetic system for controlling nuclear localization of proteins in mammalian cells and zebrafish. We synthetically reconstructed and validated the red light-induced Arabidopsis thaliana phytochrome B nuclear import mediated by phytochrome-interacting factor 3 in a non-plant environment. Based on this principle we induced nuclear import and activity of target proteins by the spatiotemporal projection of light patterns using a smartphone display. A synthetic transcription factor was translocated into the nucleus of mammalian cells and zebrafish to drive transgene expression. We describe the first plant phytochrome-based optogenetic in vivo application in vertebrates and expand the toolbox of available light-regulated molecular devices.

The development of such complex cellular networks requires suitable molecular cloning methods facilitating the implementation of the underlying design. Here, we describe AQUA (advanced quick assembly), a simple and versatile seamless assembly approach. It does not require any kits, enzymes or preparations of reagents and is the simplest assembly cloning protocol to date. We demonstrate the applicability and versatility of AQUA Cloning in selected proof-of-principle applications. These include (i) targeted insertion-, deletion- and site-directed point-mutagenesis, (ii) combined cloning and protein expression, (iii) combinatorial cloning, and (iv) the one step, one pot de novo assembly of multiple DNA fragments into a single circular plasmid encoding a complex light- and chemically-regulated Boolean A NIMPLY B logic operation.